1、柱壓過高

可能是微粒堵塞． 柱床膨脹，不可逆吸附， 細菌生長等造成的。也有可能是系統反壓問題， 例如阻尼器堵塞，進樣器堵塞， 管路或連接口堵塞。 在線過濾器不干凈， 壓力傳感器不準確等。

2、柱效低

可能是色譜柱被污染、 過濾片部分堵塞、色譜柱內的死體積造成，例如流動相pH值或者組成不合適造成固定相損失。 流動相急劇變化造成固定相物理損壞， 機械振動造成固定相產生裂縫，柱床收縮或干枯。也有可能是儀器連接的問題， 認真檢查進樣器、檢測器、 管路、 保護柱和在線過濾器等是否連接好，也可能是色譜柱沒有平衡好， 進樣量過大等問題。

3、重復性差、不出峰、回收率低

可能是色譜柱被污染， 流動相 pH值或者組成不合適造成固定相損失 ， 樣 品溶劑 不同或樣品本身不穩定， 固定 相極性過強或者流動相極性過弱． 或者發生非特異性吸附。也可能梯度實驗時平衡時間不足，溫度波動， 流動相組成改變， 樣品溶劑不同， 樣品穩定性不好，方法的開發不好， 緩沖液的酸堿度不合適或者緩沖能力不足。2100433B

高效液相色譜柱柱效和保護柱

拿到一根新柱時，一定要先看其使說明，然后測柱效，定期檢測柱效， 保留在新色譜柱上得到的色譜圖，并記錄條件， 定期檢測儀器的譜帶展寬。 若應用于在線監測， 應對色譜柱提供在線的物理保護和化學保護， 例如采取安裝在線過濾器， 自裝填料保護柱和預裝保護柱等。在線過濾器的作用是防止顆粒在柱頭累計，優點是基本不影響柱效， 在需要高柱效的時候常用， 常更換的消耗品是濾芯和墊圈保護柱的作用是防止柱子被化學污染。缺點是多數保護柱影響色譜柱的柱效， 特別是在用微柱時，常用的是普通 自裝填料的保護柱。最近新出的一些保護柱例如Sentry—guard保護柱， 它的特點是高質量、高效填料、 增加分析柱效、對臟樣品載荷能力大 ，能延長保護柱的壽命，手可擰緊接頭，安裝時不需要工具，省時省，可換芯式設計，能采用各種不同的填料，主要適用于非常臟非常復雜的樣品本底，例如生化樣品，環境樣品和食品等，或者不想做太多的圃相萃取，不想降低柱效果等情況。

高效液相色譜柱清洗

對所做的樣品要有充分的了解，用對該樣品洗脫能力最強的流動相清洗，對于硅膠柱，先用甲醇洗去極性雜質，然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷 100 — 20OraL依次活化，對于鍵和相柱，一般用甲醇一氯仿一甲醇一水依次沖洗，每種色譜柱有特定的清洗方法，一定要看其使用說明。

高效液相色譜柱存放

存放前除去雜質和鹽，采用合適的存放溶劑，避免色譜柱床的干枯，避免機械振動，防止細菌生長，注意存放的溫度。

高效液相色譜柱填充劑的要求

最常用的色譜柱填充劑為化學鍵合硅膠。反相色譜系統使用非極性填充劑，以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用，辛基硅烷鍵合硅膠和其他類型的硅烷鍵合硅膠（如氰基鍵合硅烷和氨基鍵合硅烷等）也有使用。正相色譜系統使用極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜系統使用離子交換填充劑；分子排阻色譜系統使用凝膠或高分子多孔微球等填充劑；對映異構體的分離通常使用手性填充劑。

填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響供試品的保留行為和分離效果。孔徑在15nm（1nm=10?）以下的填料適合于分析分子量小于2000 的化合物，分子量大于2000 的化合物則應選擇孔徑在30nm 以上的填料。除另有規定外，分析柱的填充劑粒徑一般在3μm~10μm 之間。粒徑更小（約2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內徑約2mm），使用微徑柱時，輸液泵的性能、進樣體積、檢測池體積和系統的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當的調整。當對其測定結果產生爭議時，應以品種正文規定的色譜條件的測定結果為準。

高效液相色譜柱溫度的要求

以硅膠為載體的普通鍵合固定相的使用溫度通常不超過35℃，為改善分離效果可適當提高色譜柱的使用溫度，但不能超過60℃。

高效液相色譜柱流動相的要求

流動相的pH 值應控制在2～8 之間。當pH 值大于8 時，可使載體硅膠溶解；當pH 值小于2 時，與硅膠相連的化學鍵合相易水解脫落。當色譜系統中需使用pH 值大于8 的流動相時，應選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機-無機雜化填充劑或非硅膠填充劑等；當需使用pH 值小于2 的流動相時，應選用耐酸的填充劑，如具有大體積側鏈能產生空間位阻保護作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑，或有機-無機雜化填充劑等。

液相色譜柱的結構：

a、空柱由柱接頭、柱管及濾片組裝而成。

柱接頭采用低死體積結構，柱接頭是兩端螺紋組件，一端是為7/16英寸內螺紋，另一端是3/16英寸的內螺紋（國內外已規范化）。7/16英寸內螺紋與1/4英寸柱管（Φ6.35mm）連接，中間放置壓環用于密封。3/16英寸的內螺紋與1/16英寸（Φ1.57mm）的連接管連接，中間也放置壓環用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時，用Φ1.57mm連接管通過空心螺釘壓環后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上（連接管通過壓環后露出的管長度應嚴格控制在2．5mm長或其他固定尺寸）。

在兩端柱接頭內，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片（或濾網），用于封堵柱填料不被流動相沖出柱外而流失。空柱各組件均為316L不銹鋼材質，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑，以避免腐蝕。

b、柱填料：

液相色譜柱的分離作用是在填料與流動相之間進行的，柱子的分類是依據填料類型而定。

正相柱：多以硅膠為柱填料。根據外型可分為無定型和球型兩種，其顆粒直徑在3—10 μm的范圍內。另一類正相填料是硅膠表面鍵合—CN，-NH₂等官能團即所謂的鍵合相硅膠。

反相柱：主要是以硅膠為基質，在其表面鍵合十八烷基官能團（ODS）的非極性填料。也有無定型和球型之分。

常用的其他的反相填料還有鍵合C8、C4、C2、苯基等，其顆粒粒徑在3—10 μm之間。