該技術操作簡便快速,可以分辨用其它方法(如密度梯度離心法)所無法分離的DNA片段。當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色,在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶,從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外,還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶,用于以后的克隆技術操作。
生物化學與分子生物學(一級學科);方法與技術(二級學科) 。
以凝膠(如聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠
等)為支撐物的區帶電泳。
參照實驗要求選擇相應規格型號的電泳儀,才能確保經濟、耐用、簡單、合理。因為高、低壓電泳儀內部結構特征不同,由于高壓電泳儀常附加有多項功能,而且高壓電泳儀絕不能空載運行(容易造身傷害、內部器件損壞),導...
電泳涂裝一般包括四個同時進行的過程: 1、電泳:在直流電場的作用下,正,負帶電膠體粒子向負,正方向運動,也稱泳動。 2、電解:電極上分別進行著氧化還原反應,反而在電極上形成氧化與還原現象。 ...
電泳漆,也叫電泳涂料,現在還有很多人沿用“電泳漆”的稱呼,而不用“電泳涂料”。隨著常規噴涂的缺陷不斷浮現,電泳開始變得越來越普及。 電泳漆也開始不斷更新換代,從陽極電泳漆到陰極電泳漆,從單組分電泳漆到...
凝膠電泳被廣泛用于分子生物學、遺傳學和生物化學:1.大的DNA或者RNA分子通常利用瓊脂糖凝膠電泳(agarose gel electrophoresis)分離,也可以使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。2.蛋白質的凝膠電泳通常在加入十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠中進行(SDS-PAGE),或者非變性凝膠電泳,或二維電泳。 SDS-PAGE 蛋白質凝膠電泳圖。 3.毛細管電泳 4.酶譜
法(zymography) 5.變性梯度膠凝電泳(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE) 瓊脂糖和聚丙烯酰胺可以制成各種形狀、大小和孔隙度。瓊脂糖凝膠分離DNA片度大小范圍較廣,不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。聚丙烯酰胺分離小片段DNA(5-500bp)效果較好,其分辯力極高,甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快,可容納相對大量的DNA,但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。一般實驗室多用瓊脂糖水平平板凝膠電泳裝置進行DNA電泳。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、 DNA的分子大小: 線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。
2、 瓊脂糖濃度
一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、DNA分子的構象
DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動最快,而開環雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支持基質,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中,在中性pH值下帶負電荷的DNA向陽極遷移,其遷移速率由下列多種因素決定:
1、 DNA的分子大小:
線狀雙鏈DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA分子量對數成反比,分子越大則所受阻力越大,也越難于在凝膠孔隙中蠕行,因而遷移得越慢。
2、 瓊脂糖濃度
一個給定大小的線狀DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對數與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。分離小于0.5kb的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb的DNA分子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。
3、 DNA分子的構象
DNA分子處于不同構象時,它在電場中移動距離不僅和分子量有關,還和它本身構象有關。相同分子量的線狀、開環和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不一樣的,超螺旋DNA移動最快,而開環雙鏈DNA移動最慢。如在電泳鑒定質粒純度時發現凝膠上有數條DNA帶難以確定是質粒DNA不同構象引起還是因為含有其他DNA引起時,可從瓊脂糖凝膠上將DNA帶逐個回收,用同一種限制性內切酶分別水解,然后電泳,如在凝膠上出現相同的DNA圖譜,則為同一種DNA。
4、 電源電壓
在低電壓時,線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加,不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長,片段越大,因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大,因此電壓增加,瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段有效分離所加電壓不得超過5V/cm。
5、嵌入染料的存在
熒光染料溴化乙啶用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA,染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀DNA遷移率降低15%。
6、離子強度影響
電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠),電導率最小,DNA幾乎不移動,在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液),則電導很高并明顯產熱,嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。 對于天然的雙鏈DNA,常用的幾種電泳緩沖液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸],TBE(Tris-硼酸和EDTA),TPE(Tris-磷酸和EDTA),一般配制成濃縮母液,儲于室溫。
電腦三恒多用電泳儀-DYY-12;電腦三恒多用電泳儀-DYY-11;電腦三恒多用電泳儀-DYY-12C;半干式碳板轉印電泳儀(槽);DNA回收電泳儀(槽)DYCP-43B型等。
按支持物的物理性狀不同,電泳可分為
(1)濾紙為支持物的紙電泳
(2)粉末電泳: 如纖維素粉,淀粉,玻璃粉電泳
(3)凝膠電泳:如瓊脂,瓊脂糖,硅膠,淀粉膠,聚丙烯酰胺凝膠電泳
(4)緣線電泳:如尼龍絲,人造絲電泳
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評分: 4.8
實驗 7 聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理 一 聚丙烯酰胺凝膠電泳( polyacrylamide gel electrophoresis, 簡稱 PAGE),由稱盤狀電泳。 這種電泳是在區帶電泳的基礎上, 以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物, 采用電泳 基質的不連續體系(即凝膠層的不連續性、緩沖液離子成分的不連續性、 pH 的不連續性及 電位梯度的不連續性) ,使樣品在不連續的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區帶(厚度為 10-2cm),然后再進行電泳分離。 圓盤電泳名稱來源即由于此法的原理是依靠基質的不連續性( discontinuity ),湊巧在垂 直柱形凝膠上分散出的區帶也很象圓盤狀( discoid shape),取“不連續性”和“圓盤狀”的 英文字頭“ disc”。因此英文名稱為“ disc electrophoresis”,中文直譯為盤狀電泳。 儀器裝置:如 圖 A 所示,上下兩個
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電泳設備使用注意事項 ( 1)一般金屬表面的電泳涂裝,其工藝流程為: 預清理→上掛→除油→水洗→除銹→水洗→磷化→水洗→鈍化→電泳→噴淋→水洗→烘 干→下掛。 (2)電泳工件的底材及前處理對電泳涂膜有極大影響。 鑄件一般采用噴砂或噴丸進行除銹,用棉紗清除工件表面的浮塵,用 80#~120#砂紙清 除表面殘留的鋼丸等雜物。 鋼鐵表面采用除油和除銹處理, 對表面要求過高時, 進行磷化和 鈍化表面處理。 黑色金屬工件在陽極電泳前必須進行磷化處理, 否則漆膜的耐腐蝕性能較差。 磷化處理時,一般選用鋅鹽磷化膜,厚度約 1~2μm,要求磷化膜結晶細而均勻。 (3)在過濾系統中,一般采用一級過濾,過濾器為網袋式結構,孔徑為 25~75μm。 電泳涂料通過立式泵輸送到過濾器進行過濾。從綜合更換周期和漆膜質量等因素考慮, 孔徑 50μm 的過濾袋最佳,它不但能滿足漆膜的質量要求,而且解決了過濾袋的堵塞問題。
1. 電泳儀的輸出達不到設定值
電泳儀的輸出值狀態遵循“歐姆定律”:電壓U=電流I×(電泳槽)電阻R
電阻R相對不變的情況下,U、I、P(功率P=電流I×電壓U)中任意1個參數恒定,其他參數也隨之恒定;而任意1個參數變化,其他參數也隨之正比變化。
如果電泳儀的輸出電壓U達不到預置值,應首先觀察I或P是否已經恒定,或者已經達到電泳儀所規定的最大I或P(JY電泳儀均有明確指示燈標志)。如果尚未達到極限值,將已經恒定I或P的設置調大(有必要的話至極限值),才能夠提高電壓輸出。
如果電泳儀的電流I達不到預置值,可調整電壓U或功率P。如果電泳儀的功率P達不到預置值,可調整電壓U或電流I。
2. 電腦控制電泳儀過壓報警
1)檢查是否空載使用。
2)是否電泳槽未加緩沖液。
3)是否電泳槽鉑金絲斷。
3. 過流保護
1)是否存在電泳槽短路現象。
2)緩沖液是否選錯。
4. 漏電保護
1)是否有液體濺入儀器內部或輸出接口上。
2)是否有很多灰塵落入儀器內部。
電泳儀是實現電泳分析的儀器。電泳是一種帶電分子在電場中向著電性相反的電極移動的現象。利用電泳現象進行物質分離的技術,稱電泳技術 。
1. 首先用導線將電泳槽的兩個電極與電泳儀的直流輸出端聯接,注意極性不要接反。
2. 電泳儀電源開關調至關的位置,電壓旋鈕轉到最小,根據工作需要選擇穩壓穩流方式及電壓電流范圍。
3. 接通電源,緩緩旋轉電壓調節鈕直到達到的所需電壓為止,設定電泳終止時間,此時電泳即開始進行。
4. 工作完畢后,應將各旋鈕、開關旋至零位或關閉狀態,并撥出電泳插頭。