凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時，由于它們的分子量不同而表現出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行"繞道"運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。

根據層析物質分子量的大小選擇不同型號的凝膠，如除鹽和除游離的熒光素，則可選用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分離蛋白質單體，G200多用于分離蛋白質凝膠聚合體等。

稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱(或室溫)中充分膨脹，或在沸水中煮，膨脹時間應根據不同型號的凝膠而定()。

為使粒子均勻一致需進行浮選，即加入凝膠粒子后，輕輕攪拌，靜置20min，傾去沉淀的粒子，如此反復數次即可。

層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時，柱床體積應為樣品體積的25~100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4~10倍。柱太短，影響分離效果。柱長一些，分離效果好，但柱太長，則延長分離時間，樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細，會發生"器壁效應"，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對于除鹽來說應為1︰5~1︰25;對于純化蛋白質來說應為1︰20~1︰100。

裝柱過程基本同離子交換層析柱。

樣品體積不宜過多，最好為床體積的1%~5%，最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大，濃度過大粘度大，分離效果差，一般不超過4%。

洗脫液應與膨脹一致，否則更換溶劑，凝膠體積會發生變化，影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液(0.14Mol/L NaCl)。

同離子交換層析。

當樣品的各組分全部洗脫下來之后，即可加入新的樣品，繼續使用。保存方法有三種:

⑴ 在液相中保存最方便，即于凝膠懸液中加入防腐劑(一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰)或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。

⑵ 用完后，以水沖洗，然后用60%~70%酒精液沖洗，凝膠體積縮小，即在半收縮狀態下保存。

⑶ 長期不用者，最好以干燥狀態保存，即水洗凈后，用含乙醇的水洗，逐漸加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽濾干，于60℃~80℃干燥后保存。

凝膠過濾層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網狀結構的凝膠的分子篩作用，根據被分離物質的分子大小不同來進行分離。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

凝膠是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品溶液在凝膠內運動時，由于它們的分子量不同而表現出速度的快慢，在緩沖液洗脫時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行“繞道”運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。

凝膠層析是按照蛋白質分子量大小進行分離的技術，又稱之凝膠過濾，分子篩層析或排阻層析。單個凝膠珠本身象個"篩子"。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。如果將這樣的凝膠裝入一個足夠長的柱子中，作成一個凝膠柱。當含有大小不同的蛋白質樣品加到凝膠柱上時，比凝膠珠平均孔徑小的蛋白質就要連續不斷地穿入珠子的內部，這樣的小分子不但其運動路程長，而且受到來自凝膠珠內部的阻力也很大，所以越小的蛋白質，把它們從柱子上洗脫下來所花費的時間越長。凝膠中只有很少的孔徑可接受大的蛋白。因此，大的蛋白質直接通過凝膠珠之間的縫隙首先被洗脫下來。凝膠過濾所用的凝膠孔徑大小的選擇主要取決于要純化的蛋白質分子量。