華安縣湖林中心小學學生宿舍及食堂工程 施 工 招 標 文 件 招標編號：華公共交易, 2008? 22號 招標單位（蓋章） ：華安縣 湖林中心小學 聯系地址：華安縣 湖林中心小學 法定代表人或其授權委 托人 （簽字或 蓋章）： 聯系人：闕先生 聯系電話： 13605073525 華安縣公共資源交易中心 二○○八年十一月 目 錄 第一部分 投標須知 ............................................. 1 投 標 須 知 前 附 表 ............................................ 1 招標投標活動日程安排表 ........................................ 2 一、總 則 . ................................................. 2 1

香石竹（Dianthus caryophyfllus L.）為石竹科石竹屬常綠亞灌木花卉,是世界著名的切花之一,其栽培種及野生種的資源有效保存對香石竹的國產化至關重要。超低溫保存（-196℃）是無性繁殖的植物種質資源最安全經濟的保存方法。超低溫保存方法中常用的為玻璃化法,近年來在傳統玻璃化法上發展出來小液滴法,即將植物材料經玻璃化處理后,在鋁箔上滴成小液滴,后直接投入液氮進行迅速冷凍。由于凍存及解凍速度快,組織不易形成冰晶,易成活再生,是一有發展前景的方法。超低溫保存中,莖尖大小及結構的完整性對超低溫保存的成活率及恢復培養均有影響。我們以香石竹為模式植物,結合包埋法及小液滴法的特點,對相關技術進行改進,探索一種適用于植物莖尖超低溫保存方法及冷凍植株后再生的技術。試材為香石竹紅花品種,從上海花卉市場購買。切取花莖繁殖試管苗,獲得花莖無性繁殖系。取組培繼代3個月以上的無菌組培苗。莖尖超低溫保存的試驗方法為：1、常規玻璃化法：（1）剝取1～2mm無菌苗莖尖,接種到含0.3 mol·L-1蔗糖濃度的MS培養基中,在25℃下培養1～3d;（2）經預培養后,將莖尖置于含預處理液（含2 mol·L-1甘油及0.4 mol·L-1蔗糖的MS培養液）的2ml冷凍管中,于室溫下處理60min,然后將預處理液吸出,換入預冷玻璃化保護劑PVS2中在冰浴中處理60～120min;（3）冷凍管換入預冷新鮮PVS2約0.5ml,迅速投入液氮中保存。解凍取出在液氮中凍存1 h以上的冷凍管,立即放入40℃水浴中快速解凍2 min。（4）莖尖在室溫下用含1.2mol·L-1蔗糖的MS培養液洗滌2～3次,每次5～10 min。（5）洗滌后的莖尖在濾紙上吸干后,轉移至恢復培養基中暗培養,等莖尖返綠并有萌動跡象時再轉入MS固體培養基中常光培養。2、小液滴法：步驟（1）、（2）同常規玻璃化法;（3）在凍存前5min將含有1個莖尖的液滴（約5ul）滴在5mm×20mm的無菌鋁箔條上,每個鋁箔條含5個莖尖,將含液滴的鋁箔條直接投入裝滿液氮的安培管中。（4）解凍時直接將含液滴的鋁箔條投入洗滌液中進行解凍20 min。步驟（5）同上。3、改良小液滴法：（1）剝取1～2mm無菌苗莖尖,浸入2%的無鈣離子海藻酸鈉溶液中輕蘸,即用鑷子將莖尖輕放在3mm×20mm無菌濾紙小條上,每個濾紙條上放5～10個莖尖;（2）將含有莖尖的濾紙小條浸入到0.1%氯化鈣溶液中,經10min固定,在無菌濾紙上吸干多余液體;（3）將帶有莖尖的濾紙小條放入0.3 mol·L-1蔗糖的MS液體或固體培養基中,培養1～3d;（4）經預培養后,將帶有莖尖的濾紙小條置于預處理液（含2 mol·L-1甘油及0.4 mol·L-1蔗糖的MS培養液）中于室溫下處理60min,然后轉入玻璃化保護劑PVS2中在冰浴中處理60～120min;（5）將帶有莖尖的濾紙小條直接投入液氮中,長期保存可轉移至無菌冷凍管;（6）解凍時將帶有莖尖的濾紙小條由管中拿出后迅速放入含1.2 mol·L-1蔗糖的MS培養液解凍及洗滌20min;（7）將帶莖尖的濾紙條在無菌濾紙上吸干后放入恢復培養基進行培養,經恢復培養后莖尖可直接生長成植株。結果表明：3種玻璃化法凍存的香石竹莖尖成活率及再生率均可達80%。其中小液滴玻璃化法在優化程序下進行凍存,最高存活率可達95%,高于常規玻璃化法（82%）及改良小液滴玻璃化法（87%）。恢復培養時,最快1d即可見莖尖萌動,再生時間較常規玻璃化法要短3～5d,但再生率不穩定（60%～100%）,易形成愈傷組織及玻璃化苗。改良小液滴法成活率（80%～90%）略高于常規玻璃化法,再生時間與常規玻璃化法相同（7～13d）,植株再生率均在80%以上且植株生長健壯一致。改良小液滴法結合包埋法及小液滴法的特點,并采用濾紙小條為操作載體,以批量處理莖尖以提高操作效率,減少在操作過程中機械損傷,從而達到穩定的成活率及再生率,受操作者水平影響較小,可用于種質庫批量化植物莖尖資源超低溫保存。